Электрофорез в агарозном геле, как он работает и его использование

Заполните форму ниже, и мы вышлем вам по электронной почте PDF-версию книги «Электрофорез в агарозном геле, как он работает и его использование».

Заполните форму ниже, чтобы разблокировать доступ ко ВСЕМ аудиостатьям.

Простые законы физики диктуют, что когда ток подается на среду, содержащую заряженные частицы, эти частицы будут мигрировать в сторону противоположного заряда. В зависимости от среды, через которую они перемещаются, другие характеристики, такие как размер присутствующих видов, могут повлиять на их перемещение, что приведет к разделению. Это основа, на которой построены методы электрофореза, такие как электрофорез в агарозном геле – методы, которые широко используются в науках о жизни.

В этой статье мы рассмотрим, как работает электрофорез в агарозном геле, как его можно интерпретировать и некоторые его цели.

Электрофорез — это метод, в котором используется электрический ток для разделения ДНК, РНК или белков на основе их физических свойств, таких как размер и заряд.

Электрофорез в агарозном геле — это форма электрофореза, используемая для разделения фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) в зависимости от их размера. Отрицательно заряженная ДНК/РНК мигрирует через поры агарозного геля к положительно заряженному концу геля при приложении электрического тока, при этом более мелкие фрагменты мигрируют быстрее. Полученные полосы затем можно визуализировать с помощью ультрафиолетового (УФ) света.

Однако РНК1 имеет тенденцию образовывать вторичные структуры – иногда несколько разных видов для одного и того же фрагмента – которые влияют на способ ее миграции. Следовательно, наблюдаемые полосы не всегда отражают свои истинные размеры, а изображения размыты. Поэтому нативные агарозные гели (где условия не нарушают естественную структуру аналитов), как правило, не используются для анализа размеров РНК, хотя они могут дать оценку количества и целостности. Альтернативы включают нозерн-блоттинг и электрофорез в денатурирующем агарозном геле2, в которых используются условия, способные разрушать вторичные структуры.

Агарозные гели также можно использовать для разделения белков3 в зависимости от их размера и заряда (в отличие от ДНК/РНК, заряд белков различается в зависимости от включенных в них аминокислот). Однако из-за большого размера пор в агарозных гелях белки часто разделяются в полиакриламидных гелях, которые вместо этого имеют меньшие поры, что обеспечивает большее разрешение для небольших белковых молекул.

Поэтому до конца этой статьи мы сосредоточимся на электрофорезе ДНК в агарозном геле.

Агароза является компонентом агара. Он образует трехмерную гелевую матрицу из спиральных молекул агарозы в сверхспиральных пучках, удерживаемых водородными связями, с каналами и порами, через которые могут проходить молекулы. При нагревании эти водородные связи разрываются, превращая агарозу в жидкость и позволяя ее вылить в форму, прежде чем она снова восстановится (рис. 1).

Процент агарозы, включенной в гель, влияет на размеры пор и, следовательно, на размер молекул, которые могут пройти через них, и скорость, с которой они это делают. Чем выше процент агарозы, тем меньше размер пор, следовательно, тем меньше молекул могут пройти и тем медленнее миграция. В лаборатории молекулярной биологии для повседневного разделения ДНК обычно используется 0,7–1% агарозный гель, обеспечивающий хорошую и четкую дифференциацию фрагментов в диапазоне 0,2–10 т.п.н. Более крупные фрагменты можно разделить с помощью гелей с более низким процентным содержанием, но они становятся очень хрупкими и с ними трудно обращаться, в то время как гели с более высоким процентным содержанием обеспечивают лучшее разрешение мелких фрагментов, но они хрупкие и могут затвердевать неравномерно.

Гель-электрофорез используется для разделения смесей биомакромолекул, таких как ДНК, РНК и белки. Этот метод разделяет молекулы по размеру и/или заряду. Это достигается путем протягивания молекул через гель, содержащий крошечные поры, с использованием электрического поля.

Поскольку ДНК не видна невооруженным глазом, во время отверждения в гель включается интеркалирующий краситель, такой как бромид этидия (EtBr). Он связывает ДНК и флуоресцирует в УФ-свете, позволяя визуализировать фрагменты ДНК. Чем больше ДНК, тем ярче полоса.